Структура, катализ, транспорт хитина и избирательное ингибирование хитинсинтазы.

Nature Communications, том 14, номер статьи: 4776 (2023) Цитировать эту статью

Доступы 1927 г.

13 Альтметрика

Подробности о метриках

Хитин является одним из наиболее распространенных природных биополимеров и служит важнейшим структурным компонентом внеклеточного матрикса, включая клеточные стенки грибов и экзоскелеты насекомых. Хитин, являющийся линейным полимером β-(1,4)-связанного N-ацетилглюкозамина, синтезируется хитинсинтазами, которые признаны мишенями для противогрибковых и противонасекомых препаратов. В этом исследовании мы определили семь различных криоэлектронных микроскопических структур хитинсинтазы Saccharomyces cerevisiae в отсутствие и в присутствии гликозильного донора, акцептора, продукта или пептидилнуклеозидных ингибиторов. В сочетании с функциональным анализом эти структуры показывают, как донорные и акцепторные субстраты связываются в активном центре, как гидролиз субстрата приводит к самовсасыванию, как открывается трансмембранный канал, проводящий хитин, и как ингибиторы пептидилнуклеозидов ингибируют хитинсинтазу. Наша работа обеспечивает структурную основу для понимания функции и ингибирования хитинсинтазы.

Хитин является вторым по распространенности природным полисахаридом на Земле после целлюлозы, и каждый год живые организмы производят около 100 миллиардов тонн хитина1. Хитин является основным компонентом клеточных стенок грибов, экзоскелета ракообразных и насекомых и играет важную роль в размножении, росте и развитии этих организмов2. Хитин представляет собой длинноцепочечный полимер β-(1,4)-связанного N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) и синтезируется хитинсинтазой в плазматической мембране3,4. Хитинсинтаза катализирует образование β(1 → 4) гликозидных связей в хитине, используя УДФ-активируемый GlcNAc (UDP-GlcNAc) в качестве донора сахара и одновременно транспортируя полисахаридный продукт наружу через мембрану (рис. 1а).

Синтез и схема транспорта хитина Chs1. b Анализ UDP-Glo ​​гликозилтрансферазы in vitro с очищенным Chs1 в буфере с (WT) или без (noGlcNAc) GlcNAc. Анализ в условиях WT также проводили с ЭДТА, трипсином, NikkoZ или PolyB. В качестве контроля использовали реакцию без Chs1. Точки данных представляют собой среднее значение ± SD в трех экземплярах. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных. c Анализ синтеза хитина in vitro с очищенным Chs1 в буфере с (WT) или без (noGlcNAc) GlcNAc. Анализ в условиях WT также проводили с ЭДТА и трипсином. В качестве контроля использовали реакцию без Chs1. Точки данных представляют собой среднее значение ± SD в трех экземплярах. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных. г Крио-ЭМ-карта и атомная модель димера апо Chs1. e Мультяшное изображение мономера Chs1. Полипептид показан радугой от N-конца к C-концу. Предполагаемый активный сайт выделен оранжевым кружком. Предполагаемый канал транспортировки хитина обозначен фиолетовой стрелкой. f Карикатурная топология мономера Chs1. g Карта домена Chs1. Помечены основные домены и мотивы. Невидимая N-концевая область выделена белым цветом.

У Saccharomyces cerevisiae хитинсинтаза в основном кодируется CHS1, CHS2 или CHS3. Одновременный нокаут всех трех генов летален для дрожжей5. ScChs1 и ScChs2 принадлежат к одному и тому же семейству хитинсинтаз, которое содержит разное количество трансмембранных спиралей от ScChs36. ScChs1 и ScChs2 ответственны за синтез первичной перегородки и связаны с разделением клеток в цитокинезе, тогда как ScChs3 отвечает за образование хитина в зачаточном кольце и хитина, диспергированного в клеточной стенке5,7,8,9,10,11. Предыдущие исследования показали, что Chs1 находится в основном в форме зимогена и может активироваться путем протеолиза3,12,13.

Хитинсинтаза принадлежит к семейству инвертирующих гликозилтрансфераз 2, содержащих складку GT-A, которое также включает гиалуронан и целлюлозосинтазы14,15. В последние годы сообщалось о структурах гиалуроновой и целлюлозосинтаз, что дало структурное представление об их рабочих механизмах16,17,18,19,20,21. Однако структура хитинсинтазы не определена, что затрудняет механистическое понимание каталитических и хитинтранспортных механизмов хитинсинтазы.